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丹膝颗粒组成药味UPLC指纹图谱的1次稳态投料量研究

发布时间:2022-07-06 11:57:47 来源:火狐体育网址 作者:火狐体育直播

  指纹图谱,采用总量统计矩、信息熵和信息量分析方法获得指纹图谱的动态性参数,并根据遗传统计学原理获得单味药材及全方的丹膝颗粒组成药味的指纹图谱动态性可用总量统计矩、信息熵、信息量进行分析,据此可获得稳态的一次投料量,据此投料生产可保证丹膝颗粒质量的稳定。

  丹膝颗粒由丹参、牛膝、天麻、牡丹皮、赤芍、川芎、地黄、淫羊藿、桑寄生、栀子、决明子、火麻仁共12味药材组成,具有养阴平肝、熄风通络、清热除烦功效;用于中风病中经络恢复期瘀血阻络兼肾虚证,症见半身不遂、口舌歪斜、舌强语蹇、偏身麻木、头晕目眩、腰膝酸软等,脑梗死恢复期见上述诸症状者[1]。该方临床疗效确切,但基础研究薄弱,为了提升该产品的科技含量,进行二次开发和有效组分中药的研制,在进行药效学研究前需摸清该方的成分动态变化规律;为了生产出质量稳定均一颗粒剂,需对药材饮片的指纹图谱和稳态性提取工艺中的1次投料量进行研究,以便控制该颗粒剂的质量稳定均一性。

  本实验采用中药指纹图谱的总量统计矩、信息熵和信息量进行成分印迹性的动态评价,获得多批次样本间的RSD,再采用Hardy-Weinberg平衡的1次投料量公式计算出稳态性投料量,以指导实际工业化生产,获得质量稳态性丹膝颗粒制剂。

  总量统计矩分析法是运用统计矩原理定性定量表征中药指纹图谱的分析方法[7-9]。该法将中药指纹图谱色谱峰的响应曲线转化成正态分布概率密度函数曲线,先获得单个色谱峰的统计矩参数,再利用统计矩的加合性获得总量零阶矩(AUCT)、总量一阶矩(MCRTT)、总量二阶矩(VCRTT)3个参数来反映整张指纹图谱的特征。总量零阶矩为曲线下的n个色谱峰面积总和,按公式(1)计算;总量一阶矩MCRTT,为n个色谱峰的平均保留时间,按公式(2)计算;总量二阶矩VCRTT为n个色谱峰的平均保留时间方差,按公式(3)计算;其中AUCT可用于对来自于中药的成分组成进行定量分析,表征整体成分的含量变化;MCRTT、VCRTT2个参数可用于中药指纹图谱的定性分析,表征成分组成(构成比)发生的变化,3个参数就能定性定量地分析1张指纹图谱的特征,反映出成分的动态变化规律。

  Ai表示第i峰的峰面积,λi表示第i峰的保留时间,σi表示第i峰的保留时间标准差,共有n个色谱峰

  信息熵是离散值的概率性表达,中药材指纹图谱上每个峰对应1个化学成分,中药成分复杂多样,每个化学成分可看作1个离散信息元,峰的强度即表明其化学信息显现的概率,且此概率受色谱条件、成分相互作用等的综合影响,因此中药指纹图谱色谱峰的出峰状态可用信息熵和信息量进行表征[10-12],信息熵表征指纹图谱所携带成分的信息单元多少,信息量表示指纹图谱的信息量大小。

  中药指纹图谱的色谱峰的“出现”与“不出现”可用信息熵(Δ S i e)表示,反映1个体系的混杂程度,按公式(4)计算;而信息量(Δ S iq)要在特征峰信息熵的基础上乘以这一色谱条件下的总面积AT,其中信息量按公式(5)计算。

  wi为第i峰的峰面积百分比,m为色谱峰的总峰数,W0为总含量或单位投料量,AT为总响应面积

  因此可用中药指纹图谱的总量统计矩参数及信息熵、信息量来表征指纹图谱的动态特征,分析各批次样本的差异性。

  中药材多以动植物入药,来源于自然界,具生物多样性,在环境(没有选择、突变、迁移和遗传漂变)稳定的情况下其成分呈多态性,但宏观上应遵循Hardy-Weinberg群体平衡定律[13-14],即当中药的生长环境稳定后,经过相当长的时间,其遗传基因变异频率与基因型频率每代保持不变,中药材的群体整体质量处于稳定。由于基因的变异频率可通过中药有效成分群指纹图谱质量属性的变化得以反映,因此测定中药有效成分群指纹图谱质量属性信息,按生物统计学求算获得1次投料单元样本数目,乘上单元重量就可以得到1次总投药量[15]。对于某一产地中药材的加工饮片,当大于一定量的样本投料量投料进行生产时,其成分处于Hardy-Weinberg平衡的稳态性质量之中,其指纹图谱的总量统计矩和信息参数就处于稳定,若以大于此量进行勾兑,则中药成分指纹图谱的特征信息量所体现的差异被勾兑消失,质量处于稳定均一之中,若以小于此量进行勾兑,则中药成分指纹图谱特征信息量差异处于波动之中,其批间成分质量在一定的上下限进行波动,因此中药成分的波动上下限与投料量相关[16]。以信息量为横坐标,各信息出现的频率为纵坐标,得到1张信息量——频率近似正态分布曲线,运用统计学原理,则其稳态时的投料样本数按公式(6)计算。

  n为投料样本数,也可为测试“单位”,tα, n-1为界值α(v=n-1)时的t检验界值,μβ为犯II型假阴性错误概率β对应的可信限,Δ Siq为信息量均数,σ iq为信息量方差,也可为平均分子连接性指数、总量统计矩参数及各种物理参数等

  按当α=0.05,β=0.05(tα, n-1+μβ=10.8),Δ S i q, i-≤·10%时,也就是置信系数为0.05,质量控制在有效期含量规定内(制剂生产过程中一般认为药物变化的差值不得低于原值的10%时,其质量是稳定的),因此可变为公式(8)。

  因此,只要测出同一产地或多个产地中药指纹图谱总量统计矩、信息熵和信息量的变异系数RSD,可确定单味药味的稳态投料量,根据处方的比例计算整个复方的总稳态投料量(Y)。

  m为处方中药味的个数,处方质量为B1、B2、B3、…、Bm;首先通过各饮片指纹图谱信息量的变异系数计算出各饮片的稳态投料量为A1、A2、A3、…、Am。A i为各药味的稳态投料量最大者,该药味的处方用量为Bi。以Ai为基准,按处方比例依次放大其他药味的1次稳态投料量,同时与按单一药味计算出的1次稳态投料量比对,若按处方比例的1次稳态投料量小于单一药味的1次稳态投料量,应以单一药味计算出的1次稳态投料量按比例放大到全方后,再得到全方的稳态投料量Y,按1次稳态投料量公式就能获得整体质量稳定的总样本大小,亦统计遗传学上特征参数稳定1次勾兑投料量,当可实现中药质量的稳定。

  Acquity UPLC H-Class型超高效液相色谱仪,美国沃特世公司;RE-2000A旋转蒸发器,巩义市中天仪器科技有限公司;ZDHW调温电热套,北京中兴伟业仪器有限公司;YHC-A6英衡精密电子秤,哈尔滨众汇衡器有限公司;MS205DU电子天平,梅特勒-托利多仪器上海有限公司;H1850R型台式高速冷冻离心机,湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;EKup-II-20T超纯水机,长沙市科临电子科技有限公司。

  丹膝颗粒处方:丹参15 g,牛膝12 g,天麻3 g,牡丹皮10 g,赤芍12 g,川芎5 g,地黄12 g,淫羊藿9 g,桑寄生12 g,栀子6 g,决明子6 g,火麻仁6 g。丹参为唇形科鼠尾草属植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge .的干燥根及根茎;牛膝为苋科牛膝属植物牛膝Achyranthes bidentata Bl.的干燥根;天麻为兰科天麻属植物天麻Gastrodia elata Bl.的干燥块茎;牡丹皮为毛茛科芍药属植物牡丹Paeonia suffruticosa Andr.的干燥根皮;赤芍为毛莨科芍药属植物芍药Paeonia lactlora Pall.的干燥根;川芎为伞形科藁本属植物川芎Iigusticum chuanxiong Hort.的干燥根;地黄为玄参科地黄属植物地黄Rehmannia glutinosa Libosch.的干燥块根;淫羊藿为小檗科淫羊藿属植物淫羊藿Epimedium brevicornum Maxim.的干燥叶;桑寄生为桑寄生科钝果寄生属植物桑寄生Taxillus chinensis (DC.) Danser的干燥带叶茎枝;栀子为茜草科栀子属植物栀子Gardenia jasminoides Ellis的干燥成熟果实;决明子为豆科决明属植物决明Cassia obtusifolia L.干燥成熟种子;火麻仁为桑科属植物Cannabis sativa L.的干燥成熟种仁。上述药材每产地各5批,购于湖南中医药大学含浦校区周边药店及由本课题组成员于原产地购买,均由湖南中医药大学药学院中药炮制教研室石继连教授按《中国药典》2020年版一部有关项下要求进行鉴别,均符合规定,具体信息见表1。

  3.1.1丹膝颗粒全方供试品溶液取1/3处方量药材,即丹参5 g,牛膝3 g,天麻1 g,牡丹皮3.3 g,赤芍4 g,川芎1.67 g,地黄4 g,淫羊藿3 g,桑寄生4 g,栀子2 g,决明子2 g,火麻仁2 g,丹参、牛膝、牡丹皮、川芎、火麻仁粉碎成粗粉,加10倍量的70%乙醇回流提取2次,每次1 h,滤过,滤液合并,回收乙醇并浓缩至生药质量浓度为1 g/mL(60℃)的清膏,备用;上述各药渣及其余生地黄等7味饮片加10倍量水煎煮2次,第1次1.5 h,第2次1 h,合并滤液,滤过,滤液浓缩至生药质量浓度为1 g/mL(60℃)的清膏,与上述各清膏合并,浓缩至生药质量浓度为1.5 g/mL(60℃)的清膏;取2 mL,挥干溶剂,加入50%甲醇复溶,定容至5 mL,超声10 min,12 000 r/min、4℃离心15 min,取上清液过0.22 μm微孔滤膜,取续滤液,得全方供试品溶液。

  3.1.2单味饮片供试品溶液取单味饮片各10 g[6,15],丹参、牛膝、牡丹皮、川芎、火麻仁粉碎成粗粉,加10倍量的70%乙醇后同上法提取;上述5味饮片药渣与其余生地黄等各7味饮片加10倍量水后同上法提取;各饮片滤液及滤液合并液同上法浓缩至生药质量浓度为1.5 g/mL(60℃)的清膏,取2 mL,挥干溶剂,加入50%甲醇复溶,定容至5 mL,超声10 min,12 000 r/min、4℃离心15 min,取上清液过0.22 μm微孔滤膜,取续滤液,得各单味饮片供试品溶液。

  3.1.3混合对照品溶液取芍药苷、丹参酮II A、丹酚酸B、天麻素、阿魏酸、蜕皮激素、丹皮酚、橙黄决明素、川芎嗪、大黄酚、淫羊藿苷、栀子苷、槲皮素、梓醇适量,精密称定置于5 mL量瓶中,加甲醇溶解并定容至刻度,制成各对照品储备液。分别精密吸取上述对照品储备液适量,充分混合后加甲醇定容,制成上述对照品质量浓度分别为0.081、0.115、0.123、0.547、0.043、0.108、0.263、0.255、0.448、0.408、0.255、0.333、0.127、0.553 mg/mL的混合对照品溶液,过0.22 μm微孔滤膜,即得混合对照品溶液。

  3.3.1精密度试验取表1中每味药材第1个产地中第1批次饮片组成的复方,按“3.1.1”项下方法制备供试品溶液,按“3.2”项色谱条件,连续进样6次,根据所得指纹图谱计算总量统计矩、信息熵、信息量参数,其峰数的RSD为0.47%,总量零阶矩的RSD为0.35%,总量一阶矩的RSD为0.16%,总量二阶矩的RSD为0.46%,信息熵的RSD为0.09%,信息量的RSD为0.39%,结果表明仪器精密度良好,符合指纹图谱的检测要求。

  3.3.2重复性考察取表1中每味药材第1个产地中第1批次饮片组成的复方6份,按“3.1.1”项下方法平行制备供试品溶液6份,按“3.2”项色谱条件测定指纹图谱,计算总量统计矩、信息熵、信息量参数,其峰数的RSD为2.92%,总量零阶矩的RSD为1.47%,总量一阶矩的RSD为1.28%,总量二阶矩的RSD为1.12%,信息熵的RSD为0.66%,信息量的RSD为1.25%,表明该试验重复性良好。

  3.3.3稳定性试验取表1中每味药材第1个产地中第1批次饮片组成的复方,按“3.1.1”项下方法制备供试品溶液,按“3.2”项色谱条件分别在制备后0、2、4、6、8、12、24 h进样,记录色谱图,计算总量统计矩、信息熵、信息量参数,其峰数的RSD为1.49%,总量零阶矩的RSD为0.24%,总量一阶矩的RSD为0.16%,总量二阶矩的RSD为0.94%,信息熵的RSD为0.28%,信息量的RSD为0.36%,表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

  3.5 15批丹膝颗粒的饮片及制剂的UPLC指纹图谱的总量统计矩参数及信息熵分析

  按总量统计矩法分析获得其总量统计零、一、二阶矩参数和信息熵、信息量,其均值及RSD列于表2。可知,零阶矩、信息量的平均值RSD>10%,说明这2个参数能作为中药指纹图谱的定量分析指标,反映整体成分的含量变化;而一阶矩、二阶矩和信息熵的平均值RSD<10%,说明这3个参数可用于中药指纹图谱的定性分析,中药整体受控于超分子“印迹模板”作用机制,来源于不同产地的同一药材成分构成比的变化符合要求,即在宏观上表现出整体性质的稳定。

  根据各单味饮片信息量的RSD大小、操作单位及处方用量,按稳态性1次投料公式计算得各12味饮片及全方特征参数的1次稳态投料量,结果列于表3。对比各特征参数的1次稳态投料量,按累积信息量的RSD变化,全方需投2.13 kg,川芎的1次稳态投料量最小(1.03 kg),而桑寄生1次稳态投料量为最大(30.58kg),也就是只要按桑寄生信息量的1次稳态投料量投料,其它参数会更稳定。以桑寄生信息量的1次稳态投料量作为基准,再按处方比例依次放大其他药味及全方的1次稳态投料量,结果发现天麻的1次稳态投料量最小(9.32 kg),而丹参最大(46.58 kg),全方需投335.35 kg,虽远远大于累积的全方1次投料量(2.13 kg),但能保证药物成分的均一性与稳定性。

  本研究采用UPLC法建立了丹膝颗粒各单味饮片及全方的指纹图谱,在色谱条件探索过程中,流动相研究了水-甲醇、水-乙腈、0.05%甲酸水溶液-乙腈、0.05%醋酸水溶液-乙腈、0.1%磷酸水溶液-乙腈,发现0.1%磷酸水溶液-乙腈条件下,色谱图基线平稳,各色谱峰分离较好,出峰较多,峰形较好,故流动相选用0.1%磷酸水溶液-乙腈;进样量考察了1、2、3、4、5 μL,发现进样量为3 μL时,峰数较多,峰面积较大,故选择了进样量为3 μL;柱温考察了25、30、35℃,发现柱温为30℃时,色谱峰分离度较好,出峰时间适中,故柱温选择了30℃。体积流量考察了0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL/min,发现体积流量为0.4 mL/min时,出峰时间适中,洗脱效果较好,故体积流量选择了0.4 mL/min。

  据信息量的变异系数RSD变化,计算出全方需投2.13 kg,川芎的1次稳态投料量最小(1.03 kg),而桑寄生最大(30.58 kg),也就是只要按桑寄生的1次稳态投料量投料,其它参数会更稳定。以桑寄生信息量的1次稳态投料量作为基准,再据处方比例依次放大其他药味及全方的1次稳态投料量,并与以单一药味计算出的1次稳态投料量对比,发现天麻按处方用的1次稳态投料量小于单独使用天麻计算出的1次稳态投料量,故以单独使用天麻的1次稳态投料量按比例放大到全方后,再得到全方的稳态投料量,这也是处方用天麻的1次稳态投料量最小的原因,最终得到全方1次稳态投料量为335.35kg,各药味的投料量依次为丹参46.58kg,牛膝37.26 kg,天麻9.32 kg,牡丹皮31.02 kg,赤芍37.26 kg,川芎15.53 kg,地黄37.26 kg,淫羊藿27.95 kg,桑寄生37.26 kg,栀子18.63 kg,决明子18.63 kg,火麻仁18.63 kg,该投料量为保证制剂生产的最小投料量,虽远远大于《中国药典》规定,若能以大于等于该最小投料量进行投料和工业化生产,则能保证药物成分的均一性与稳定性。

  中药客体成分受环境和遗传双重影响,成分具多样性,从源头上影响中药提取物的质量稳定均一,中药提取工艺长期缺乏对中药材遗传基因多态性的认识[16-19],没有明确中药材及复方的最小投料量是造成中药有效成分群制剂质量不稳的关键因素,也是以多少量实现勾兑必须解决的首要问题。测定中药有效成分群指纹图谱信息量的变异概率曲线,按统计学原理求得有效投料单元数量,乘上单元重量就可以得到总投料量,在大于总投料量的前提下投料进行中药有效成分群的炮制、提取、勾兑,就能获得中药制剂群体Hardy-Weinberg平衡质量,以实现中药质量的均一与稳定。

  来 源:王敏存,贺琪珺,周燕子,陈定芳,杨学斌,李 萍,李海英,黄 胜,邓凯文,潘 雪,贺福元.丹膝颗粒组成药味UPLC指纹图谱的1次稳态投料量研究 [J]. 中草药, 2022, 53(3): 704-711 .返回搜狐,查看更多

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